Producción de fructanasas en reactor por lotes repetidos con células inmovilizadas de Kluyveromyces marxianus a partir de fructanos de Agave tequilana

Abstract

Las fructanasas son enzimas que pertenecen a la familia de las glicosilhidrolasas. Estas actúan sobre los enlaces β-fructosilos presentes entre las unidades monoméricas de los fructanos, dando como resultado la liberación de D-fructosa y D-glucosa. Estas enzimas se usan en la industria alimenticia para la producción de jarabes de fructosa, fructooligosacáridos y prebióticos. Diferentes investigaciones han expuesto la producción de inulinasas (fructanasas obtenidas de fructanos lineales) en cultivo por lote con levaduras del género Kluyveromyces. Este trabajo tiene como objetivo estudiar la producción de fructanasas en reactores por lotes repetidos con células inmovilizadas de Kluyveromyces marxianus var. drosophilarum, a partir de fructanos de Agave tequilana y recuperación de las enzimas por precipitación enzimática por solventes orgánicos. Se evaluó la inmovilización de células de Kluyveromyces marxianus por atrapamiento en tres soportes: poli vinil alcohol vinílico (PVA), alginato de calcio y agar. Se realizaron cultivos con células inmovilizadas en los tres soportes, de manera independiente, para producir fructanasas. La actividad fructanasa al final de los cultivos (45h) fue similar con las células inmovilizadas en agar y en alginato de calcio (16.3 U/mL con ambos soportes). Sin embargo la productividad fue mayor en alginato de calcio. Por otra parte, la actividad enzimática con células en PVA fue muy pobre (1.36 U/mL de fructanasas). Por consiguiente, se optó por la inmovilización en alginato calcio para la siguiente etapa. Se llevó a cabo un cultivo en bioreactor a 30°C, pH 5.5, 300 rpm y un flujo de aire de 0.3 vvm, después de 48 h se obtuvieron 20.08 U/mL de fructanasas, un rendimiento de 1321 U fructanasas /g fructanos y una productividad de0.52 U/mL-h. 14 La producción de fructanasas en lotes repetidos después de 4 ciclos fue de 67.75 U/mL de fructanasas en 66 horas. Con un rendimiento promedio de 1187 U fructanasas /g fructanos y una productividad de 1.09 U/mL-h. Se comparó la producción de fructanasas en lotes repetidos utilizando NaOH ó NH4OH para ajustar el pH automáticamente, con la finalidad de sustituir el NaOH por NH4OH. Sin embargo en el tercer ciclo se observó que el soporte se deformaba y liberaba a las células. Para la conservación y concentración de las fructanasa obtenidas se comparó la recuperación de las enzimas por precipitación con tres solventes: acetona, etanol e isopropanol, a su vez cada solvente se probó a tres diferentes proporciones solvente/extracto (v/v); 1:1, 1:2, y 1:3 Para los tres solventes, la mayor actividad fructanasa se obtuvo a una relación 3:1 solvente/extracto. Con etanol, se logró la mayor recuperación de enzimas en buffer de acetatos 0.1 M pH 4.7, a las 8 horas de contacto, con una recuperación del 96.79%. Con la acetona se alcanzó el 80.58% de recuperación de fructanasas, en agua a las 12 h, de manera similar a la acetona, con el isopropanol se obtuvo un 76.20% de recuperación de fructanasas. Los resultados de este estudio muestran que es posible incrementar los rendimientos y productividades de las fructanasas a través de la reutilización de células inmovilizadas de Kluyveromyces marxianus var. drosophilarum en lotes repetidos. Además, es factible alcanzar altos porcentajes de recuperación de fructanasas por precipitación con solventes orgánicos como el isopropanol.