GENERACIÓN DE NUEVOS VECTORES DE EXPRESIÓN GÉNICA PARA LA BACTERIA ACTINOBACILLUS SUCCINOGENES

Abstract

En este trabajo se presentan tres metodologías para generar vectores de expresión génica. La primera propuesta para generar un vector fue la digestión con enzimas de restricción y ligación de los fragmentos deseados como ya se ha hecho en trabajos anteriores [1]. Se esperaba generar vectores que contenga el origen de replicación “RepB” y el casete de resistencia a cloranfenicol (Cm) “cat” de pMC-Express, más el promotor “trc” y el gen represor de lac “lacIq” de pTrc99A2, además de una segunda construcción a la cual sólo se le adicionaría el promotor trc de pTrc99A2lacI- Después de un análisis de los sitios de corte de los tres plásmidos en cuestión. Se propuso digerir pMC-Express con AclI [2] y XhoI [3]. pTrc99A2 con PfoI [4] y PagI [5]. pTrc99A2lacI- con PscI [6] y PagI [5]. Como ninguno de los sitios de unión son cohesivos, se propuso utilizar la polimerasa de ácido desoxirribonucleico (ADN) Fragmento Klenow [7] que deja los extremos romos para posteriormente unirlos con una ligasa de ADN T4 [8]. Dado que PfoI [4] y PagI [5] son enzimas susceptibles a metilación dam, se electroporarón los plásmidos pTrc99A2 y pTrc99A2lacI- por separado en células electrocompetentes de Escherichia coli JM110 wt dam- [15], obteniendo las versiones pTrc99A2 dam- y pTrc99A2lacI- dam-. Las digestiones se llevaron a cabo siguiendo los protocolos de las enzimas [2-7], para después ligar los fragmentos equimolarmente con ayuda de la ligasa ADN T4 [8]. El producto de la ligación se electroporó en células electrocompetentes de E. coli DH5α [9], las células transformadas se recuperarón en medio LB con cloranfenicol como marcador de selección a una concentración de 30 μg/mL, después de incubación no se observó crecimiento. Una segunda propuesta se realizó con base a la clonación de la extensión circular de la polimerasa (CPEC, por sus siglas en inglés “Circular polymerase extension cloning”). La clave del éxito de CPEC está en seleccionar y diseñar cuidadosamente las secuencias superpuestas entre el vector y el inserto, de modo que ambas partes compartan una temperatura de fusión del ADN (Tm por sus siglas en inglés “melting temperature”) muy similar [10]. Con base a la metodología anterior se escogieron dos secciones de pMC-Express y dos secciones de pTrc99A2 que también sirvieran para pTrc99A2lacI-. Se tomaron las cuatro regiones que replican la región deseada y se designaron como delantero (F del inglés “forward”) y trasero (R del inglés “reverse”) para cada plásmido, al mismo tiempo se 2 añadieron nucleótidos a los extremos de los cuatro oligos con el fin de que los extremos añadidos en los oligos de pMC-Express sean cohesivos con los extremos añadidos de pTrc99A2 en la dirección deseada. Una vez diseñados los oligos se procedió a hacer las reacciones de la cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés “Polymerase Chain Reaction”) de ambos plásmidos con sus respectivos oligos y la polimerasa de ADN Phusion con las condiciones indicadas en la ficha técnica de la enzima [11], cuando se obtuvieron ambos productos se recuperaron del gel y se procedió a utilizar el protocolo de CPEC [10]. El producto de CPEC se electroporó en células electrocompetentes de E. coli DH5α [9], las células transformadas se recuperarón en medio LB más 20 μg/mL Cm, después incubación no se observó crecimiento. La tercera propuesta fue mediante enzimas de digestión con extremos cohesivos [12], con el diseño de oligos para pMC-Express, que le aporten sitios de corte de pTrc99A2 PfoI [4] y SalI [13]. Con los oligos diseñados se procedió a realizar la PCR con la polimerasa de ADN Phusion [11] para pMC-Express con los oligos FpMCSalI y RpMCPfoI. Se realizaron las digestiones del producto de la PCR y de pTrc99A2 por separado, ambas con PfoI [4] y SalI [13], se recuperó el ADN esperado y se ligó con ligasa de ADN T4 [8] una relación equimolar vector:inserto, el producto de las reacciones se electroporó en células electrocompetentes de E. coli DH5α [9], las células transformadas se recuperarón en medio LB con 10 μg/mL Cm, después de incubación, se observaron 133 colonias y se analizaron 23; se les extrajo el ADN plasmídico [14] y con enzimas de restricción se digirieron con el fin de linealizar los plásmidos, se cargaron en una cámara de electroforesis. De los 23 sólo 16 presentaban un tamaño de aproximadamente 5606 pb, lo cual confirmaba que la construcción se realizó de manera correcta, 9 de las 16 colonias se resembraron y se les extrajo el ADN extracromosómico (plásmido) [14] mismo que ahora presentaba un tamaño de 4000 pb aproximadamente, lo cual demostró que la construcción realizada probablemente es inestable. En paralelo se repitió la técnica CPEC seleccionando a una concentración de Cm de 10 μg/mL y se obtuvieron 33 colonias, de las cuales se analizaron 8, y a pesar de que algunas parecían haber sido exitosas, las restricciones no concuerdan con lo esperado, por lo que se deben proponer otras metodologías para llegar al producto deseado.