Identificación de genotipos de virus del papiloma humano en México y efecto de la proteína E6 de VPH de alto y bajo riesgo, sobre la expresión de genes asociados a respuesta inmune

Abstract

Introducción: El Cáncer Cervico Uterino (CaCU) es aún una de las neoplasias de mayor importancia en salud pública, ya que se encuentra en el cuarto lugar entre las neoplasias más frecuentes en población femenina a nivel mundial y en México es la segunda causa de mortalidad entre las mujeres entre 25 y 65 años. El Virus del Papiloma Humano (VPH) es el principal agente etiológico asociado al desarrollo de CaCU, y se encuentra presente en el 99.7% de las muestras de tejido cervical con esta patología. En población mexicana se ha reportado que los genotipos de VPH más prevalentes en CaCU son: VPH 16, 18, 58, 31, y 45; sin embargo, la genotipificación en la mayoría de estos estudios se ha realizado con metodologías que permiten la identificación de un número limitado de genotipos de VPH o utilizan métodos que no permite la identificación de co-infecciones. Una genotipificación adecuada de VPH es de suma importancia, ya que se ha observado que la respuesta inmune del hospedero contra genotipos específicos de VPH, juega un papel crucial en la eliminación de la infección o progresión hacia lesiones precursoras y CaCU. Objetivo: Identificar mediante secuenciación masiva, genotipos de VPH en muestras de cepillados cervicales de mujeres mexicanas, así como evaluar el efecto de la proteína E6 de VPH de alto y bajo riesgo, sobre la expresión de genes asociados a la respuesta inmune en un modelo de queratinocitos humanos. Materiales y métodos: A partir de DNA de muestras cervicales provenientes de tejido sin lesión cervical, con NIC I o CaCU, se determinó la positividad a VPH mediante la amplificación de la región L1 de VPH utilizando PCR punto final y los oligonucleótidos PGMY09/11; las muestras positivas fueron genotipificadas mediante la prueba diagnóstica del Linear Array. Adicionalmente, las muestras positivas a VPH fueron genotipificadas mediante secuenciación masiva; en una primera etapa se utilizaron los oligonucleótidos PGMY09/11 y en una segunda etapa se incluyeron también los oligonucleótidos FAP. El análisis bioinformático de las secuencias obtenidas para la identificación de los genotipos de VPH, se realizó mediante las plataformas GS Reference Mapper, Bowtie y Megablast, utilizando las referencias de los genotipos de VPH y sus variantes obtenidas de la base de datos PaVE. Para la identificación de genes asociados con la respuesta inmune se utilizó un modelo celular in vitro, realizado en la línea celular HaCaT, de la cual se generaron diversas clonas que expresan E6 de VPH16, 18 u 84, mediante un sistema lentiviral. Se extrajo ARN de cada una de las clonas y se realizaron microarreglos de expresión con la plataforma de NimbleGen. Para el análisis del microarreglo de expresión se utilizó el software CLC Main Work Bench. Resultados: Por medio de secuenciación masiva y el uso del set de oligonucleótidos PGMY se lograron identificar genotipos de VPH no reportados previamente en población mexicana, los cuales son VPH32, 44, 74, 102 y 114. Además, se determinó que los genotipos 102 y 114 son detectados por la prueba de Linear Array como VPH83 y 84, respectivamente. Mediante secuenciación masiva utilizando los oligonucleótidos FAP, se lograron identificar 27 genotipos de VPH que no son detectados por pruebas comerciales como el Linear Array, dentro de ellos VPH- 4, 8, 12, 19, 20, 23, 24, 30, 43, 47, 74, 80, 87, 90, 98, 101, 102, 103, 107, 108, 111, 121, 123, 134, 142, 146, y 150. Con respecto a la identificación de variantes de VPH en muestras secuenciadas individualmente con diagnóstico de NIC I y CaCU; se encontraron variantes de VPH frecuentes pertenecientes al género alfa, especie 9, como el VPH16 A1, A2, A4 y D3, el VPH58 con las variantes A1, A2 y B1. Las primeras se encontraron muy frecuentes en ambos grupos diagnóstico y las segundas solo en las pacientes con NIC I. La variante A2 de VPH30 se encontró muy frecuentemente en las pacientes con NIC I. En el modelo in vitro, se determinó que E6 de VPHs de alto o bajo grado modifican diferencialmente la expresión de genes que modulan la respuesta inmune en queratinocitos, se vieron especialmente expresados de manera diferencial algunos pertenecientes a vías de quimiocinas, como son CXCL6 y CXCL8 que se encontraron muy elevados en las clonas infectadas con E6 de VPH16 y 18; mientras que la clona infectada con E6 de VPH-84 no presenta cambios significativos. Conclusiones: La genotipificación de VPH mediante secuenciación masiva permitió identificar 35 genotipos de VPH adicionales a los que son detectados por pruebas comerciales; algunos de ellos con posible potencial oncogénico. Por otro lado, se observó que existen genes de la respuesta inmune, que son regulados de manera diferencial por las proteínas E6 de distintos genotipos de VPH, indicando que la respuesta genotipo específica es importante para la eliminación de la infección.