Producción de análogo de insulina SCI-57, mediante expresión transitoria en plantas de Nicotiana benthamiana

Abstract

La Federación Internacional de Diabetes proporciona evidencia del crecimiento constante de la diabetes en todo el mundo. Sin embargo, a nivel mundial, la insulina está disponible sólo en el 23% de los países de bajos ingresos, e irónicamente cuesta más en esos países que los de ingresos altos. La falta de acceso a la insulina sigue siendo un impedimento clave para un tratamiento exitoso y da como resultado complicaciones innecesarias y muertes prematuras. Por lo tanto, el estudio de nuevas plataformas para la expresión de insulina y análogos de insulina con el fin de favorecer la disponibilidad y reducir los costos es de suma importancia. SCI-57 es un análogo de insulina que tiene una afinidad diez veces mayor al receptor de insulina, mayor resistencia a la degradación térmica que la insulina, mitogenicidad nativa y efecto biológico. Las plantas se han utilizado como plataformas para la producción de proteínas biológicamente activas. La expresión transitoria en Nicotiana benthamiana (Nb) ha generado proteínas con alto rendimiento y bajos costos de producción a gran escala. En este trabajo nos propusimos producir el análogo de insulina SCI-57, mediante expresión transitoria en plantas de Nicotiana benthamiana (Nb). Para aumentar la expresión de SCI-57, la construcción del gen incluyó una ubiquitina en el extremo N-terminal y en el extremo C-terminal la señal KDEL. Se evaluó la co-expresión del canal iónico del virus de la influenza M2 y su efecto sobre el rendimiento y la calidad del análogo de insulina SCI-57. Aunque el uso de M2 aumenta la expresión génica relativa, tiende a alterar la secuencia de aminoácidos de SCI-57, lo que favorece a la formación de oligómeros. La purificación de SCI-57 se logró mediante FPLC de intercambio catiónico y ultrafiltración con membranas de 3 kDa a partir del extracto de hoja de Nb. La identificación de la proteína se confirmó mediante SDS-PAGE, RP-HPLC y espectrometría de masas, contrastando su ausencia en muestras de plantas de Nb no agroinfiltradas. Los geles bidimensionales de electroforesis diagonal exhibieron la presencia de puentes disulfuro en SCI-57. La alta capacidad del extracto de P-SCI-57 para estimular la captación de glucosa en los adipocitos terminales, y su baja capacidad adipogénica (pro-obesidad), lo convierten en un candidato óptimo para reemplazar la insulina nativa. Por el contrario, la muestra de P-SCI-57/M2 presentó baja (relativa) capacidad para estimular la captación de glucosa con un marcado efecto proapogénico. Las plantas agroinfiltradas muestran un perfil proteómico con sobreexpresión de proteínas relacionadas con el estrés, enzimas que modifican la pared celular y proteínas relacionadas con la patogénesis; las cuales no fueron encontradas en plantas no agroinfiltradas. Nuestros resultados sugieren que es viable producir el análogo de insulina SCI-57 por expresión transitoria en Nb.