Evaluación de la expresión de los receptores WNT en cáncer cérvico-uterino y su regulación por las proteínas virales E5, E6 y E7 de VPH 16, 18 y 84

Abstract

Introducción: El cáncer cervicouterino (CaCU) es la cuarta neoplasia más común en mujeres mundialmente. Su principal factor etiológico es la infección por el Virus del Papiloma Humano (VPH); sin embargo, se requieren otras alteraciones para su desarrollo, entre ellas, la activación aberrante de la vía de señalización WNT/β-catenina. Esta vía de señalización regula procesos de diferenciación, proliferación, migración y polaridad celular.En el genoma humano, se han descrito diferentes proteínas que funcionan como receptores y co-receptores WNT incluyendo a miembros de las familias Frizzled (FZD), proteínas 5 y 6 relacionadas con los receptores de lipoproteínas de baja densidad (LRP5-6), receptor huérfano ROR (1 y 2), receptor tirosin cinasa (RYK), VANGL1 y 2 y familias de proteoglicanos. Estos receptores son regulados intracelularmente por fosforilación de proteínas y extracelularmente por varios antagonistas. Evidencias previas han mostrado que diferentes alteraciones en la vía de señalización WNT contribuyen sustancialmente a la carcinogénesis cervical y que las oncoproteínas E5, E6 y E7 de VPH de alto riesgo modulan diversos componentes de esta vía en queratinocitos humanos. En el siguiente proyecto se evaluará el perfil de expresión de los receptores de la familia WNT en líneas celulares derivadas de CaCU y en muestras obtenidas de pacientes sin lesiones cervicales, lesiones de bajo grado y CaCU, así como la posible existencia de mecanismos de regulación de la expresión de dichos receptores dirigido por las proteínas E5, E6 y E7 de VPHs de alto y bajo riesgo. Objetivo: Evaluar la expresión de receptores de la vía WNT en líneas celulares derivadas de CaCU así como en muestras provenientes de mujeres sin lesión cervical, con lesiones cervicales de bajo grado o con CaCU. Metodología: En primer lugar, se evaluó la expresión de los receptores FZD1-FZD10, RYK, ROR1/ROR2 y VANGL2 a nivel de mRNA y proteína por medio de qPCR, RNA-Seq y citometría de flujo, en las líneas derivadas de CaCU. Asimismo, se utilizó un modelo de queratinocitos previamente establecido que expresa constitutivamente E5, E6 o E7 de VPH 16 o 18 (alto riesgo oncogénico) u 84 (bajo riesgo oncogénico). Una vez determinados aquellos receptores en donde se encontraron las mayores diferencias en la expresión entre los grupos de estudio (VANGL2), se generaron modelos de sobreexpresión en líneas celulares derivadas de CaCU, los cuales una vez establecidos se analizaron por medio de RNA-Seq para estudiar las posibles implicaciones biológicas de estos receptores en CaCU. Asimismo, se determinó por medio de qPCR y citometría de flujo la expresión a nivel de mRNA y proteína de los receptores FZD1-FZD10, RYK, y ROR1/ROR2 en cepillados citológicos de mujeres sin lesiones cervicales, lesiones de bajo grado y CaCU. Adicionalmente, se realizó la genotipificación del VPH presente en muestras mediante Linear-Array. La expresión proteica de los receptores se corroboró mediante ensayos de inmunohistoquímica en muestras embebidas en parafina.Resultados: Se determinó que a nivel de mRNA los receptores FZD9 y VANGL2 se encuentran diferencialmente expresados en líneas celulares derivadas de CaCU en comparación con lo observado en queratinocitos no tumorigénicos HaCaT. Por otra parte, la presencia de las proteínas E6 y E7 de los VPH16, 18 y 84, modulan a la baja la expresión de VANGL2 en los queratinocitos no tumorigénicos HaCaT, mientras que las proteínas E5 y E6 de los VPH16, 18 y 84 aumentan la expresión de FZD9 en el mismo modelo de queratinocitos. Asimismo, se determinó que a nivel de proteína se sobreexpresan los receptores FZD4 (p=0.03067), FZD9 (p=0.0453), RYK (p=0.0102) y ROR1(p=0.0387) significativamente en cepillados citológicos de pacientes con CaCU en comparación con pacientes sin lesión cervical, datos que se correlacionan con lo observado en las mediciones en las líneas celulares derivadas de CaCU (HeLa, SiHa y C33a) en comparación con queratinocitos no tumorigénicos HaCaT. Finalmente, los genotipos de VPH más frecuentemente identificados fueron 16, 18, 45, 58, 33, y 59 en pacientes con CaCU y 16, 66, 6, 53, 89 y 59 en pacientes con lesiones precursoras. Las infecciones únicas fueron más frecuentes en pacientes con CaCU que en aquellas con lesiones de bajo grado. Conclusiones: Se demostró que los receptores FZD4, FZD9, RYK, VANGL2 y ROR1 se encuentran diferencialmente expresados tanto en cepillados citológicos de pacientes con CaCU como en las líneas celulares HaCaT, HeLa, SiHa y C33a. Asimismo, la presencia de oncoproteínas del VPH se encuentra modulando la expresión de los receptores evaluados. Esto sugiere que moléculas como son los receptores de la vía WNT pueden modular el proceso de carcinogénesis cervical y podrían llegar a ser utilizados como biomarcadores en esta patología.